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DNAバーコーディング

はじめに

解析対象の生物種によって,どの遺伝子領域を解析するかでだいたい以下のように決まります。しかしながら,真菌類や植物では、べストな領域は決めかねているのが状況です。

生物種  遺伝子領域
細菌 16S rRNA (1)
 真核生物 18S rRNA (2)
真菌類 (3)  ITS1:生物種によって増幅長のばらつきがITS2領域より大きい

ITS2:増幅長のばらつきが小さいとはいえ,長すぎると解析できない。

D2領域:増幅長のばらつきが小さいが、配列多様性がない。
動物  COI (4)
魚類  12S rRNA (5)
植物 (6) rbcL: 増幅長が長い(現在短くできないか検討中)

matK: PCRによる増幅成功率が低い

trnH-psbA: 増幅長がまちまち,長すぎると解析できない。 

trnL P6Loop: Taberlet et al., 2007

参考文献
(1)
(2)
(3)
(4) Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrigenhoek R. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 1994, 3: 294-299. [PDF]
(5) ,, , ,, , , ,, , , . MiFish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. ROYAL SOCIETY OPEN SCIENCE 2015. [PDF]
(6) Kress WJ and Erickson DL. A Two-Locus Global DNA Barcode for Land Plants: The Coding rbcL Gene Complements the Non-Coding trnH-psbA Spacer Region. PLoS ONE. 2007, 2(6): e508. [PDF]

プライマーの配列

細菌

Target Name  Sequence (5′→3′)  Reference
All bacteria
(16S V4)
515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA   Gregory et al., 2011
806R GGACATACHVGGGTWTCTAAT 
Pseudomonas
(16S)
 Pse435F   ACTTTAAGTTGGGAGGAAGGG Bergmark
et al., 2012.
[PDF]
Pse686R   ACACAGGAAATTCCACCACCC
Burkholderia
(16S)
BKH812F  CCCTAAACGATGTCAACTAGTTG
BKH1249R  ACCCTCTGTTCCGACCAT


真核生物

 Target   Name   Sequence (5′→3′)  Reference
Eukaryota
(18S V9)
 1389F  TTGTACACACCGCCC  Amaral-Zettler
et al., 2009
 1510R CCTTCYGCAGGTTCACCTAC 


真菌

 Target   Name   Sequence (5′→3′)  Reference
Fungi
(ITS1)
ITS1FI2   GAACCWGCGGARGGATCA Schmdt et al., 2013
ITS2   GCTGCGTTCTTCATCGATGC
 ITS1F  CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA Bazghaleh et al., 2015 
ITS2   GCTGCGTTCTTCATCGATGC
18S-F   GTAAAAGTCGTAACAAGGTTTC Findley et al., 2013 
5.8S-1R   GTTCAAAGAYTCGATGATTCAC
ITS5   GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG Blaalid et al., 2013
ITS2   GCTGCGTTCTTCATCGATGC
Fungi
(ITS2)
BITS   ACCTGCGGARGGATCA Bokulich et al., 2013 
B58S3   GAGATCCRTTGYTRAAAGTT
5.8S-F  GTGAATCATCGARTCTTTGAAC  Findley et al., 2013
28S1-R   TATGCTTAAGTTCAGCGGGTA
5.8S_Fun   AACTTTYRRCAAYGGATCWCT Unpublish data 
 ITS4_Fun AGCCTCCGCTTATTGATATGCTTAART 
 ITS3  GCATCGATGAAGAACGCAGC  Blaalid et al., 2013
 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 
fITS7 GAACACAGCGAAATGTGA  Bokulich et al., 2013
ITS4  TCCTCCGCTTATTGATATGC 
gITS7  GTGAATCATCGARTCTTTG Bokulich et al., 2013 
ITS4  TCCTCCGCTTATTGATATGC 
Fungi
(D2)
 LR1 GCATATCAATAAGCGGAGGA  van Tuinen et al., 1998 
 FLR2 GTCGTTTAAAGCCATTACGTC  Trouvelot et al., 1999 
Glomeromycetes
グロモス門
 FLR4 TACGTCAACATCCTTAACGAA   Gollotte et al., 2004
 FLR3 TTGAAAGGGAAACGATTGAAG 


植物

 Target   Name   Sequence (5′→3′)  Reference
Plants
(rbcL)
 rbcLa_F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC  
 rbcLa_R CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC
Plants
(matK)
matK 2.1f CCTATCCATCTGGAAATCTTAG   
 matK 5r  GTTCTAGCACAAGAAAGTCG
Plants
(trnH-psbA)
trnH  ACTGCCTTGATCCACTTGGC   
psbA  CGAAGCTCCATCTACAAATGG 


動物

 Target   Name   Sequence (5′→3′)  Reference
Animal
(動物)
 LCO1606  TTAATTGGAGATGATCAAAT     Folmer et al., 1994
    [PDF]
 LCO1495  ACAAATCATAAAGATATTGG
 LCO1828  GGAGCTGGTACAGGTTGAAC
 HCO1862  TGAACTGTTTACCCTCCTTT
 HCO2042  TGATCAGTACTTATTACAGC
 HCO2799  CCACGACGGTACATAGATTATGCTG
 HCO2911  GAAGCTTTAGTGTGTCAACGAGGGG
 HCO2192  TGATTTTTTGGTCACCCTGA
 HCO2768  CAACATTTTTTAGGATTAGC
Mammal
(哺乳類) 
 MiMammal-U-F NNNNNNGGGTTGGTAAATTTCGTGCCAGC   Ushio et al., 2016
[PDF]    
 MiMammal-U-R NNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG 
 Mammal
(哺乳類)
+
Elephant (象)
MiMammal-E-F NNNNNNGGACTGGTCAATTTCGTGCCAGC 
MiMammal-E-R NNNNNNCATAGTGAGGTATCTAATCTCAGTTTG 
 Mammal
(哺乳類)
+
Bear (熊)
 MiMimmal-B-F NNNNNNGGGTTGGTTAATTTCGTGCCAGC 
 MiMimmal-B-R NNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG 
Fish
(魚類)
  MiFish-U-F   NNNNNNGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC Miya et al., 2015.
[PDF]
  MiFish-U-R NNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
Fish (魚類)
+
Elasmobranchs
(板鰓類)
  MiFish-E-F  NNNNNNGTTGGTAAATCTCGTGCCAGC
  MiFish-E-R NNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
Fish (魚類)
+
Tuna (マグロ属)
 MiFish-tuna-ND5-F  NNNNNNATGTCCTTCCTCCTTATCGGCTG
 MiFish-tuna-ND5-R   NNNNNNTTGCCAGTGGCAGCTACGATC
Actinoterygii
(条鰭綱
  CGGTAAAACTCGTGCC   Jarman et al., [PDF]
   CCGCCAAGTCCTTTGGG
Copepoda
(カイアシ類)
  TGTGTGGTGGTAAACGGAG   Bissett et al., 2005
  CCGCCGACCTACTCG 
 Euphausiacea
(オキアミ類)
  TCTCAGCGCCTGGCAAGGTGTCA   Jarman et al., 2002
  CTCGGGGACGTTTTATCCGGGACGAG 
Amphipoda
(端脚類) 
AmphNSSf1 CTGCGGTTAAAAGGCTCGTAGTTGAA               Jarman et al., 2006
AmphNSSr1 ACTGCTTTRAGCACTCTGATTTAC 
 Cephalopoda
(頭足類)
CephMLSf1  TGCGGTATTWTAACTGTACT
CephMLSr1  TTATTCCTTRATCACCC
Echinodermata
(棘皮動物)
EchinNSSf1  GCGTGCTTTTATTAGGA
EchinNSSr1  CGACCATGRTARGCGCATAACG
Gastropoda
(腹足綱)
 GastNLSf1 GCGGYAACGCAAACGAAGT 
 GastNLSr1  CGAAAWTMACACCGTCTCCG
Isopoda
(ワラジムシ類)
 IsopodNSSf1  TCATGATTYATGGGATGT
 IsopodNSSr1 AAGACCTCAGCGCTCGGC 
 Ostracoda
(貝虫)
 OstracodMSSf1  GTGACAAGAAGACCCTARGAG
 OstracodMSSr1  AATCCAACATCGAGGTCA
Thoracica
(フジツボ類)
 ThorMSSf1  TTTAGAGGAACCTGCCC
 ThorMSSr1  AGCTGCACCTTTAYTTGAAG

COIプライマーは,保存性が高くない領域に設計されているため,検出できない生物種がいる。


データベース

Qiimeやusearchなどで生物種を同定する場合,参照配列と生物種名のデータが必要になります。

  遺伝子領域 データベース 
16S  greengene
12S  MitoFish
18S  SILVA
ITS領域  UNITE
COI遺伝子
ITS領域
rbcL遺伝子
matK遺伝子
trnH-psbA領域
 BOLDSYSTEMS



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