1. Convert to sam from bam

samtools view -h ./tophat_out/accepted_hits.bam > ./tophat_out/accepted_hits.sam

bamファイルは機械語で書かれていて，人間には理解できません。まずは，samtoolsでbamファイルをsamファイルに変換します。

2. Filtering

awk '$5>40{print}' ./tophat_out/accepted_hits.sam > ./tophat_out/accepted_hits_uniq.sam

ここでは，mappingのqualityが低いreadを取り除きます。例えば，あるreadが複数個所のリファレンスにmapされるなどするとqualityが低くなります。この場合はmappingのqualityが40以上(Max: 50)のreadだけ抽出します。

3. Convert to sam from bed

perl sam2bed.pl ./tophat_out/accepted_hits_uniq.sam ./tophat_out/accepted_hits_uniq.bed

次に使うintersecBedのために，samファイルをsam2bed.plを使ってbedファイルに変換します。
sam2bed.pl: http://bioinfo.au.tsinghua.edu.cn/member/xwang/share/sam2bed.pl

4. Count

intersectBed -a annotated_gene_regions.gff -b ./tophat_out/accepted_hits_uniq.bed -c > ./tophat_out/accepted_hits_uniq.count

bedetoolsの中にあるintersectBedを使って，リファレンス配列の遺伝子領域上にあるリードをカウントします。

samtoolsの詳細
bedtoolsの詳細