mapファイルの作成

Qiimeを用いた解析では，所々でmapファイルが必要になることがあります。以下のような，サンプル名と番号を追加したタブ区切りテキストを作成します。sample IDは、上記のsample nameを一致させる必要があります。

#sample ID　　　Description Soil-1　　1.Soil-1 Soli-2　　2.Soli-2 Soli-3　　3.Soli-3 Water-1　　4.Water-1 Water-2　　5.Water-2 Water-3　　6.Water-3

また，以下のように他のサンプル情報も加えることも可能です。

#sample ID　Spot　Temp　Description Soil-1　Chiba　23　1.Soil-1 Soli-2　Chiba　24　2.Soli-2 Soli-3　Chiba　25　3.Soli-3 Water-1　Syonan　23　4.Water-1 Water-2　Syonan　24　5.Water-2 Water-3　Syonan　25　6.Water-3

使い方

このスクリプト集から良く使うスクリプトを抜粋して,ご紹介します。

OTUの選択，生物種の推定，系統樹作成パイプライン
A: 16S rRNAの場合

pick_de_nove_otus.py -i input.fasta -o otus

B: ITSや18S rRNAの場合

Aで示した方法ですと系統樹まで書こうとしますが、ITSや18Sの場合、系統樹が書けないので、エラーを出力します。
そのため、パイプラインを用いることができず、バラでスクリプトを実行する必要があります。

#OTUの作成 pick_otus.py -i input.fasta -o uclust_picked_otus #代表配列を選抜 pick_rep_set.py -i uclust_picked_otus/input_otus.txt -f input.fasta -o uclust_picked_otus/input_rep_set.fasta #生物種の割り当て assign_taxonomy.py -m blast -t taxonomy_database.txt -r taxonomy_database.fasta -i uclust_picked_otus/input_rep_set.fasta -o uclust_picked_otus/uclust_assigned_taxonomy #OTUテーブルの作成 make_otu_table.py -i uclust_picked_otus/input_otus.txt -t uclust_picked_otus/uclust_assigned_taxonomy/input_rep_set_tax\assignments.txt -o otu_table.biom

リードのカウントデータの統計値を出力

各サンプルで得られているリード数や最大リード数、最小リード数を出力します。

biom summarize-table -i  otu_table.biom -o summary

サブサンプリング

統計値をみて、リード数が極端になっていたり、リード数をサンプル間で合わせたい場合は、サブサンプリングを行います。

single_rarefaction.py -i otu_table.biom -o otu_table_even100.biom -d 100

d: サブサンプルのリード数

任意の種を取り除く

根圏の菌叢を調べると、植物由来のプラスチドやミトコンドリアが多くリードが得られてしまい、本来みたかった細菌相をマスクしてしまう場合があります。その場合は指定したtaxaを取り除くことができます。

filter_taxa_from_otu_table.py -i otu_table.biom -o otu_table_non_bac_firm.biom -n p__Bacteroidetes,p__Firmicutes

任意の種のみ選択する

上とは逆にある生物目や科レベルで解析したい場合は、指定したtaxaのみ取り出すことができます。

filter_taxa_from_otu_table.py -i otu_table.biom -o otu_table_bac_firm_only.biom -p p__Bacteroidetes,p__Firmicutes

area chartとbar chartの作成

エリアチャートや棒チャートで相対的に各サンプル間の違いを表すことができます。

summarize_taxa_through_plots.py -i otu_table.biom -o taxa_summary -m map.txt -s -c Description

得られたOTUに張り付いたリードのカウント数の出力

OTU、リード数、生物種を表したタブ区切りテキストを出力します。

biom convert -i otu_table.biom -o otu_table.txt --table-type="OTU table" --to-tsv --header-key taxonomy

α多様性の解析

レアファクション解析（chao1やshannon）を行います。

alpha_rarefaction.py -i otu_table.biom -o rarefaction -m map.txt -n 10 -a -O 4 -p alpha_metrics.txt

alpha_metrics.txtには、使用したい指標を以下のように示す必要があります。

PDFで出力したい場合

make_rarefaction_plots.py -i rarefaction/alpfa_div_collated -o alpha_diversity -m map.txt -g pdf --generate_average_tables

β多様性の解析（主座標分析; PCoA）

主座標分析を行います。解析には系統樹データと最小配列数が必要です。

beta_diversity_through_plots.py -i otu_table.biom -o beta_diversity -m map.txt -t rep_ser.tre -e [最小配列数]

２D_plotで出力する場合

make_2d_plots.py -i beta_diversity/weighted_unifrac_pc.txt -o beta_diversity/weighted_2D_plot -m map.txt