Locked Nucleic Acid (LNA)とPeptide Nucleic Acid (PNA)は、DNAと似た構造をもつ人工核酸です。プライマー内にこれら人工核酸を使用することで、通常のプライマーより高い特異性とTm値の上昇が期待できます。一方で、価格が高い(2万円/本)というデメリットもあります。また、PNAは不溶化する場合があるので、LNAの使用をお勧めします。
LNAを用いた解析例
ミトコンドリアと葉緑体由来のDNA増幅を抑制するLNA
(植物サンプルで細菌の菌叢を解析する)
16S rRNAの全長を増幅するプライマー(modified 63fと1492r)を使用して細菌の16S rRNA配列を増幅させる。この時、ミトコンドリア由来のDNAには、LNA
(Mit63とMit1492)がアニーリングし、また葉緑体由来のDNAには、LNA (Pla63とPla1492)がアニーリングするため、増幅プライマーはなミトコンドリアや葉緑体由来のDNAにはアニーリングしづらくなり、目的の細菌由来のDNAのみが増幅されやすくなる。
| 増幅プライマー (modified 63f) |
YRKGCYTWAYACATGCAAGTC |
| 増幅プライマー (1492r) |
AAGTCGTAACAAGGTARCC |
| LNA-Mit63 |
GTCGAACGTTGTTTTCGGp |
| LNA-Mit1492 |
CTTCACCCCAGTCGAAGAp |
| LNA-Pla63 |
GTCGAACGGGAAGTGGTp |
| LNA-Pla1492 |
CTTCACTCCAGTCGCAAGCp |
太文字：LNA, p：リン酸化
Reference
Makoto Ikenaga and Masao Sakai. Application of Locked Nucleic Acid (LNA)
Oligonucleotide?PCR Clamping Technique to Selectively PCR Amplify the SSU
rRNA Genes of Bacteria in Investigating the Plant-Associated Community
Structures. Microbes Environ. 2014, 29(3), 286-295. [
PDF]
糸状菌由来のDNA増幅を特異的に増幅するLNA
(植物サンプルで糸状菌の菌叢を解析する)
植物の内生菌を解析しようと、ITS領域を増幅するプライマーを用いると、同時に植物由来のDNAも増幅されてしまう場合がある。真菌類のDNAを特異的に増幅するプライマー(ITS1F
KU LNA)を用いることで、その問題を解決することができる。また、論文中には植物由来のDNAを抑制するようなLNAも記載されている。
| ITS1F KU LNA |
CTYGGTCATTTAGAGGAASTAA |
太文字：LNA
Reference
Makoto Ikenaga et al., Application of Locked Nucleic Acid (LNA) Primer
and PCR Clamping by LNA Oligonucleotide to Enhance the Amplification of
Internal Transcribed Spacer (ITS) Regions in Investigating the Community
Structures of Plant?Associated Fungi. Microbes Environ. 2016, 31(3), 339-348.[
PDF]
PNAを用いた解析例
ミトコンドリアと葉緑体由来のDNA増幅を抑制するLNA
(植物サンプルで細菌の菌叢を解析する)
LNAで紹介したミトコンドリアと葉緑体由来のDNA増幅を抑制が、PNAを用いることでも可能です。
Reference
Derek S Lundberg et al., Practical innovations for high-throughput amplicon
sequencing. Nature Methods 2013, 10, 999-1002. [
PDF]
別に自分でPNAを設計する場合は、以下の注意点を守って下さい。
1.長さは18mer以内に。
2.プリン塩基(A/G)が10塩基中8塩基以上含んではいけない。
3.プリン塩基(A/G)が6塩基以上連続してはいけない。
4.Gが5塩基以上連続してはいけない。
5.自己相補的な配列を避ける。
設計できたら、以下のサイトで、PNAのTm値や上の決まりごとを計算/確認します。
(
http://www6.appliedbiosystems.com/support/pnadesigner.cfm)
問題がなければ、合成注文！！