DNAバーコディングで紹介したターゲット遺伝子を増幅する配列（灰色と茶色）にシーケンシングに必要なアダプター配列（桃色と緑色）を付加させたプライマーを用いて、PCRを行います。PCR産物を精製した後、サンプル毎にIndex（MID、バーコードとも呼ばれる）が含まれるプライマーを用いて、2回目のPCRを行います。その後、PCR産物を精製すれば、ライブラリーの完成です。ライブラリーは最終的に一番下のような構造をしています。

リードの重ね合わせ

MiSeq(Illumina)を用いてば、2x250 bp もしくは、2x300 bpのPaired-endリードが得られます。多くのプライマーセットは、Paired-endリード同士がoverlapするように設計されていおり、overlapしている部分を重ね合わせることで、2本のリードを1本のリードにします。


クオリティフィルタリング

リード長のフィルタリング

共通するリード1とリード2配列を出力

リードの重ね合わせ

FASTQからFASTAへの変換